乾貨丨HEK293細胞培養與基因編輯技巧指南_風聞

作為科研領域的“明星細胞系”，HEK293細胞在高通量文庫篩選、病毒製備、重組蛋白表達等多種實驗場景中應用廣泛。其轉染效率高、表達穩定、培養體系成熟等優勢，使其成為多個研究平台的優選工具。然而，想要在具體項目中充分發揮HEK293細胞的作用，確保實驗穩定高效，就必須注重每一個操作環節的規範與細節。本文將從細胞復甦、傳代培養、凍存保存，到轉染實驗及單克隆篩選鋪板，全面介紹HEK293細胞的關鍵操作技術與注意事項，助力科研進程更加順利！

細胞信息

細胞名稱：HEK293（人胚腎細胞）

細胞形態：上皮細胞樣，貼壁細胞

細胞培養條件：90%DMEM+10%FBS

氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%

温度：37℃

換液頻次：2-3天/次

傳代比例：1:3-1:6

細胞生長正常圖片：細胞呈不規則多邊形或梭形，邊緣清晰，類似"鋪路石"樣排列，細胞邊界清晰，單層生長不重疊。

細胞生長狀態差圖片：細胞形態會發生改變，細胞邊緣模糊，拉長、纖維化，邊緣模糊、偽足增多，出現空泡或顆粒。

細胞復甦

1. 準備：取7mL完全培養基於離心管中備用

2. 解凍：將細胞從乾冰裏取出，用鑷子夾住蓋子放入 37℃水浴中快速晃動（注意：水不能沒過蓋子），使其在1分鐘左右完全融化，直至冰塊融化至綠豆大小，停止水浴

3. 離心：將解凍後的細胞懸液轉移至離心管中，1100rpm條件下離心4分鐘，棄去上清液

4. 重懸與接種：用完全培養基重懸細胞，接種於合適大小的培養皿或培養瓶中

5. 培養：將培養皿或培養瓶置於37℃培養箱中培養，24小時後觀察細胞狀態及貼壁情況

細胞傳代（以T25瓶為例）

1. 當細胞匯合度達到80-90%時可進行傳代，傳代時在超淨台內棄去培養瓶裏的培養液，加入5mLPBS洗滌細胞1-2次

2. 加入1mL胰酶，輕輕晃動瓶子並使胰酶完全浸過細胞，將培養瓶放入培養箱孵育 1-2分鐘，待在顯微鏡下觀察到大部分細胞變圓變亮，輕輕晃動培養瓶兩側有大部分細胞脱落時，立即終止消化

3. 加入2倍胰酶體積即2mL完全培養基終止消化，然後轉移至15mL離心管中

4. 1100 rpm 室温離心 4 分鐘，離心結束，棄去上清，加入完全培養基重懸細胞

5. 細胞按照1:3-1:6比例傳代，傳代第二天觀察細胞狀態

細胞凍存

1. 收集細胞：按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中

2. 離心：1100rpm條件下離心4分鐘，去掉上清

3. 重懸與凍存：用細胞凍存液重懸細胞，按每1mL凍存液含1×10^6個細胞/mL分配到凍存管中，標註好名稱、代數、日期等信息

4. 降温與儲存：將凍存管置於程序降温盒中，-80℃冰箱中過夜後轉入液氮罐內保存

細胞培養注意事項

· 培養基和血清：確保使用正確的基礎培養基和加入適量血清，配好的完全培養基需4℃保存，建議2周內使用完畢

· 確保細胞培養環境正常

· 操作前需預熱培養基和胰酶至37℃，避免温度應激

· 傳代時機： 匯合度 80-90% 時傳代，通常每2-3天傳代一次

· 細胞傳代操作：注意消化時間和胰酶濃度，避免因消化時間過長或過短導致的細胞損傷；避免過度吹打而造成細胞膜的損傷；貼壁不均勻時可輕搖培養瓶使細胞分佈均勻

· 細胞不貼壁：檢查血清質量；使用包被過的培養器皿；改用含EDTA的0.05%胰酶（如TrypLE™），消化時間縮短至30-60秒

細胞轉染關鍵注意事項

1.細胞狀態要求：轉染前應確保細胞處於對數生長期（匯合度70%-80%），且活率高於95%（可通過台盼藍染色法檢測）。

2.温和消化：消化細胞時需嚴格控制時間，避免過度消化導致細胞損傷。

3.充分重懸：操作過程中應將細胞吹打成單細胞懸液，儘量減少細胞團塊，以提高轉染一致性。

4.試劑混勻：使用轉染試劑前須充分渦旋或混勻，確保試劑成分均勻分佈。

5.預實驗篩選：建議提前進行藥物篩選預實驗，確定最佳篩選濃度，為轉染後篩選做好準備。

6.電轉法

電轉細胞數量應適中，轉染後按合適密度接種於相應培養器皿。

電轉前需使用PBS清洗細胞1-2次，徹底去除血清殘留，防止離子干擾電轉效率。

可通過預實驗優化電轉電壓、波寬等參數。

電轉後細胞貼壁率應不低於70%。

嚴格控制電轉操作時間，避免全過程耗時過長影響細胞存活。

7.慢病毒法

正式實驗前應預實驗確定最佳感染複數（MOI）。

感染時細胞匯合度建議維持在30%-40%，不宜過高。

感染前加入助染劑Polybrene以提高感染效率。

感染24小時後須進行了換液操作。

病毒液應避免反覆凍融，以維持病毒活性。

8.脂質體法

應選擇適配HEK293細胞的脂質體轉染試劑，並通過預實驗優化轉染條件。

建議提前24小時鋪板，使轉染時細胞密度處於60%-70%。

配製複合物時，應先使用Opti-MEM稀釋DNA，再加入脂質體試劑（反向混合可能導致轉染失敗）。

稀釋後室温靜置15-20分鐘形成複合物（時間過短複合不充分，過長則毒性增加）。

添加複合物時應沿孔板邊緣緩慢逐滴加入，輕輕搖勻，避免直接吹打細胞。

鋪單克隆實驗注意事項

· 使用對數生長期的細胞進行鋪克隆，鋪克隆前細胞匯合度建議控制在70%左右

· 鋪克隆時細胞活率≥90%

· 提前預温所有試劑（包括培養基、胰酶、PBS）

· 建議使用温和消化試劑（如TrypLE Express）

· 可先進行預實驗找到合適的鋪克隆梯度，避免單克隆佔比太低

· 細胞接種96孔板時需確保細胞分佈均勻；外圍96孔加入PBS防止蒸發

· 使用“梯度稀釋法”進行鋪克隆，稀釋細胞計數後結果最好落在1*10^6-2*10^6之間

電轉法感染圖

慢病毒感染圖